Воспользовавшись отсутствием хозяина, дворня Измайловых и Сергей потешаются над Аксиньей, посадив ее в пустую бочку. Увидев это, Катерина вступается за кухарку, грозит показать свою женскую силу, поколотить зачинщика Сергея. Сергей развязно предлагает барыне побороться. В разгар борьбы появляется Борис Тимофеевич. Он гонит всех работу, а Катерине грозит, что все расскажет мужу.

День прошел. Катерина в спальне вновь томится от скуки — слова не с кем сказать. Так и пройдет жизнь в четырех стенах, за пудовыми запорами, без любви, без счастья. В дверь стучится Сергей; ему тоже скучно. Для начала он просит книжку, но книг в доме нет. Тогда опытный соблазнитель с притворным участием говорит о печальной женской доле, намекает, что неплохо бы молодой женщине дружка завести. Катерина просит его уйти, но Сергей, внезапно осмелев, обнимает ее.

По двору с фонарем бродит Борис Тимофеевич. Старику не спится: ему мерещатся воры, вспоминается, как в молодости ходил он под окнами чужих жен, иногда и в окна залезал. Завидев свет у Катерины Львовны, он решил было тряхнуть стариной, забраться к снохе, но вдруг услышал, как она прощается с Сергеем, увидел, как тот вылезает из окна и спускается по трубе. Схватив его за шиворот, Борис Тимофеевич сзывает людей и тут же избивает Сергея плетью. Утомившись, он велит запереть его в погреб и требует грибков. Катерина подсыпает в грибки отравны и подает свекру. Когда тог падает, она отбирает у него ключи и отпирает потреб. Приказники, идущие на работу, видят умирающего хозяина и зовут Священника. Катерина объясняет, что старик ночью грибков поел, а многие, их поевши, умирают. Священник охотно соглашается с ней.

В постели Катерины Львовны лежит Сергей, удрученный предстоявшим приездом Зиновия Борисовича. Он не хочет быть тайным любовником Катерины, видеться лишь ночью, а днем от всех прятаться. Катерина успокаивает его. Когда Сергей засыпает, ей чудится призрак Бориса Тимофеевича, проклинающий отравительницу. За дверями раздаются еле слышные шаги — муж вернулся с мельницы. Катерина прячет любовника и не спеша отпирает. Зиновий Борисович ехидно расспрашивает ее, а заметив мужской поясок, набрасывается с побоями. На крик Катерины выходит Сергей, вдвоем они душат Зиновия Борисовича и прячут труп в погребе.

Теперь преграды исчезли. Сегодня свадьба Катерины и Сергея. Но совесть грызет убийцу. Непонятной силой Катерину влечет к погребу. Задрипанный мужичок давно приметил это — видать, в погребе хорошие вина! Его мучит жажда. Дождавшись, когда новобрачные отбыли в церковь, он взламывает замок и, обнаружив труп, в ужасе бежит в полицию.

На съезжей уныло бездельничают полицейские. Квартальный оскорблен, что его не пригласили на свадьбу Измайловой. Городовой приводит учителя-«нигилиста», усомнившегося в Боге: он обнаружил, что душа есть не только у человека, но и у лягушки. Появляется Задрипанный мужичок. Дрожа от страха, он сообщает, что у Измайловых в погребе труп. Разом оживившиеся полицейские отправляется к Измайловым.

Свадебный пир в разгаре. Полупьяные гости со Священником во главе славословят новобрачным. Внезапно Катерина замечает, что замок на погребе сбит. Понимая, что убийство Зиновия Борисовича обнаружено, она решает бежать с Сергеем. Но поздно. В ворота стучат. Квартальный начинает издалека, но Катерина Львовна сама протягивает руки полицейским. Ее связывают. Сергей пытается бежать с деньгами, его задерживают и бьют. Новобрачных под конвоем ведут в острог.

На берегу реки партия каторжан остановилась на ночлег. Катерина и Сергей в разных группах. Дождавшись, пока все стихло, Катерина упрашивает часового пропустить ее к Сергею. Прежний любовник грубо гонит ее — это она довела его до каторги, — а сам пробирается к молодой каторжанке Сонетке. Он развязно домогается ее любви; но бывалая Сонетка не привыкла любить задаром. Она показывает свои изорванные чулки и требует, чтобы Сергей раздобыл у купчихи новые. Обманом и хитростью, притворившись больным, он выманивает у Катерины чулки и тут же, отдав Сонетке, уносит ее в лес. Катерина бросается следом, но каторжницы, обступив ее, осыпают насмешками и издевательствами неудачливую любовницу. Часовой усмиряет их. Каторжане собираются в путь. Катерина медленно подходит к Сонетке, стоящей на мостках, и вдруг, столкнув ее в воду, бросается следом. Быстрое течение уносит обеих.

«Катерина Измайлова» — опера подлинно трагического звучания. Ей свойственны редкий лаконизм и сила выражения. Действие насыщено событиями, в которых глубоко раскрываются характеры многочисленных действующих лиц. Музыкальные портреты поражают психологической точностью и проницательностью. В них использованы разнообразные краски — проникновенно лиричная русская мелодия и острогротескное переосмысление бытовых жанров, элементы пародии и возвышенный драматизм. Партия оркестра образует самостоятельный смысловой план, а многочисленные симфонические эпизоды и антракты дополняют и обобщают происходящее на сцене. Колоритный, первозданно терпкий музыкальный язык, непрерывность развития свидетельствуют о влиянии оперных традиций Мусоргского.

В 1-й картине I акта преобладают речитативные сцены, временами получающие рельефные мелодические очертания. Таков начальный речитатив Катерины «Ах, не спится больше» с ариозным заключением «Муравей таскает соломинку». В следующей сцене тоскливо-напевные или угрюмо-отрывистые фразы Катерины сплетаются с озлобленно-монотонными речами Бориса Тимофеевича, моментами срывающимися в скороговорку. Единственный музыкально завершенный эпизод картины — лицемерно горестный хор дворни «Зачем же ты уезжаешь, хозяин»; пародийно надрывная мелодия хора сопровождается легкомысленным вальсом в оркестре. 2-я картина распадается на два больших раздела. Первый — живая массовая сцена, где в стремительном музыкальном движении соединяются вопли Аксиньи, самоуверенно наглые речи Сергея, выкрики и хохот Задрипанного мужичка, дворника, приказчика и дворни. Второй раздел начинается с приходом Катерины Львовны; ее ария «Много вы, мужики, о себе возмечтали» звучит гордо и неторопливо. Симфонический антракт к 3-й картине лихорадочным возбуждением, нервным ритмом предвосхищает последующие эпизоды оперы. Этот ритм время от времени возвращается в оркестре на всем протяжении картины. В центре ее — ариозо Катерины «Я в окошко однажды увидела» — замечательный образец современного преломления русской лирической песни. Сцена Катерины и Сергея, вначале спокойная, пронизана непрерывно растущим внутренним напряжением; в музыкальной речи выпукло противопоставлены простосердечие Катерины и притворная обходительность Сергея.

II акт — драматическая кульминация оперы — включает две картины. 4-я открывается большим монологом Бориса Тимофеевича, в котором сменяются старческие жалобы, грубая игривость, бахвальство и вожделение. Любовной мелодии дуэта-прощания Катерины и Сергея сопутствуют возгласы взбешенного старика. В сценах порки и отравления особенно детально высвечиваются образы Бориса Тимофеевича и Катерины; у первого гнев, исступление внезапно сменяются невозмутимостью, ласковое обращение к Катерине — новым приступом гнева, животным страхом; у второй полные отчаяния призывы уступают место язвительным издевательским речам. Нервное напряжение этих сцен оттеняется небольшим хором работников за кулисами «Видно, скоро уж заря». Симфонический антракт, написанный в медленном торжественном движении пассакальи, концентрирует трагизм II акта. Одна из его музыкальных тем продолжает развиваться в 5-й картине. В начальной сцене выделяется надрывно-сентиментальное ариозо Сергея «Катерина Львовна, Катенька». Появление призрака Бориса Тимофеевича вызывает резкую вспышку драматизма. Диалог шепотом на фоне скупых настороженных звучаний оркестра предшествует приходу Зиновия Борисовича. Его сцена с Катериной построена на непрерывном нагнетают напряжения. Заключительная часть сцены сопровождается зловеще сухой маршевой темой в оркестре.